El gluten es la proteína mayoritaria (70-80 % del total proteico) de cereales como trigo, centeno y cebada y de sus variedades híbridas y derivados, entre otros. Desde el punto de vista químico, dicho gluten se compone de dos fracciones, separables en función de su solubilidad: mientras que las prolaminas son solubles en medios hidroalcohólicos, las gluteninas se solubilizan en medios ácidos o básicos diluidos.
Atendiendo a la cadena de aminoácidos que contienen, estas proteínas destacan por su alto contenido en prolina y glutamina, que forman parte del péptido o péptidos responsables de la toxicidad y de la respuesta inmunogénica que esta proteína genera en las personas celíacas. Aunque ambas fracciones contienen péptidos tóxicos, la mayoría de los métodos analíticos para el análisis de gluten se basan en la detección de prolaminas, que posteriormente se normaliza al gluten total, aceptando la ratio 1:1 entre prolaminas:gluteninas. Dicha ratio de consenso está sometida a controversia durante los últimos años (1).
Las técnicas analíticas diseñadas para la detección y cuantificación del gluten deben cumplir ciertas premisas, como son:
Además, los métodos analíticos deben ser robustos, es decir, en la validación de los mismos deben demostrar una buena reproducibilidad y exactitud. Adicionalmente, el equipamiento necesario y coste para su realización será accesible, sencillo y de amplio uso en los laboratorios, para facilitar el análisis rutinario de muestras.
Teniendo en cuenta estos aspectos, el Codex propuso como técnicas de elección los métodos inmunológicos (3), si bien se emplean otros métodos basados en técnicas proteómicas, genómicas o electroquímicas, entre otros (4-6).
Las técnicas inmunológicas, donde destacan los métodos ELISA (enzimoinmunoanálisis), se basan en el uso de anticuerpos específicos frente a las fracciones nocivas del gluten, junto con una reacción enzimática para la detección de las mismas.
Para cuantificar de forma fiable la presencia de gluten, es necesario tener en cuenta las variables que determinan la validez de estos métodos:
Anticuerpos utilizados
Existen varios anticuerpos comercializados a través de kits ELISA para analizar la presencia de péptidos tóxicos de gluten. El anticuerpo R5, que reconoce el epítopo QQPFP, fue declarado como método tipo I por el Codex. Otros anticuerpos, como el de Skerritt, G12 y A1, han sido también validados y aprobados en diferentes estudios (4). Aun así, se sigue investigando en búsqueda de nuevos anticuerpos o combinaciones de los mismos que resuelvan ciertas limitaciones (como sobreestimación, baja sensibilidad, interacción con avena, etc.) de los actualmente disponibles (7).
Tipo de matriz alimentaria y tratamientos tecnológicos de la industria alimentaria
El gluten está presente en muchos alimentos manufacturados, independientemente de su origen alimentario, por las propiedades viscoelásticas de esta proteína y por la versatilidad de uso de las harinas de cereales, lo que provoca la presencia de gluten oculto en alimentos, como, por ejemplo, derivados cárnicos o de verduras, que son libres de gluten por naturaleza.
Algunos ingredientes, como el chocolate o alimentos ricos en taninos y/o polifenoles, como los vegetales (alcachofas, acelgas, ciruelas pasas, etc.), las legumbres o las especias (jengibre, pimienta, comino, etc.), interfieren en el proceso analítico de extracción del gluten, subestimando su presencia en el alimento. En estos casos, y para evitar la formación de complejos que dificultan dicha extracción, se añaden sustancias proteicas, como leche en polvo desnatada, gelatina de pescado o polivinilpirrolidona.
Algunos de los tratamientos empleados en la industria alimentaria para la elaboración de los productos alimenticios provocan cambios estructurales de los péptidos de gluten que condicionan también el proceso de extracción y análisis. Por ejemplo, el tratamiento con altas temperaturas provoca la desnaturalización del gluten, que forma nuevos puentes disulfuro que dificultan el proceso de extracción. La adición de agentes desagregantes, como la guanidina, y reductores, como el 2-mercaptoetanol, facilitan la extracción hidroalcohólica (4).
El tratamiento enzimático o de hidrólisis que experimentan algunos alimentos durante los procesos de fermentación, como ocurre con las cervezas, o de preparación, como es el caso de las papillas infantiles o los almidones y siropes, provocan la ruptura de los péptidos de gluten en cadenas más cortas que dificultan su detección. En estas situaciones es imprescindible utilizar ensayos ELISA de tipo competitivo, que presentan mayor sensibilidad analítica (8, 9).
Tipos de ensayo elisa: sándwich y competitivo
tipos de ensayo elisa: sándwich y competitivo
- El ensayo ELISA sándwich se basa en el empleo de dos tipos de anticuerpos en el mismo pocillo, uno de captura, pegado a la base del pocillo, y otro anticuerpo conjugado a la enzima que desarrollará color (figura 1). Por ello, se requiere que en el péptido de gluten aparezcan, al menos, dos epítopos específicos para que se unan a dichos anticuerpos de captura y conjugado. En este caso, la detección de color es directamente proporcional a la presencia de gluten.
- En el ensayo ELISA competitivo, el gluten presente en la muestra a analizar compite con un péptido de gluten adherido al pocillo por su unión al anticuerpo conjugado a la enzima que produce un compuesto coloreado (figura 1). Si la muestra contiene mucha cantidad de gluten, este forma un complejo con el anticuerpo conjugado que se elimina durante los lavados, evitando su unión al antígeno pegado al pocillo. De este modo, al contrario que en el método anterior, cuanto menor sea el color detectado, mayor es el contenido en gluten.
Otras variables condicionantes del ensayo analítico
En el momento actual no existe un material de referencia certificado, y el que mayor consenso científico internacional tiene es la gliadina del Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity. Sin embargo, debido a la variabilidad en la composición de las diferentes fracciones de gluten, es complicado diseñar un material de referencia que pueda ser utilizado como estándar o patrón de gluten para cualquier alimento o cereal (9). Poniendo como ejemplo el trigo, existen diferencias en cuanto al contenido de gluten en función de la variedad de trigo, de la cosecha anual o, incluso, de variables ambientales (10).
Otra limitación analítica puede derivarse de los procesos tecnológicos que provocan la deamidación de los residuos de glutamina y asparragina, que se convierten en glutamato y aspartato. Este hecho se produce porque dificulta el reconocimiento de los nuevos epítopos formados por parte de los anticuerpos utilizados en los métodos inmunológicos (11).
No obstante, a pesar de que aún existen aspectos por mejorar, el control analítico riguroso para determinar la contaminación con gluten de productos alimentarios, junto con la aprobación de reglamentos europeos que regulan su contenido en alimentos, ha contribuido a reducir de forma significativa la presencia de péptidos tóxicos e inmunogénicos en alimentos destinados a su uso por la población celíaca, mejorando la seguridad alimentaria de este colectivo (12).
Bibliografía
1. Scherf KA, Poms RE. Recent developments in analytical methods for tracing gluten. J Cereal Sci. 2016;67:112-22.
2. Reglamento de Ejecución (UE) n.° 828/2014 de la Comisión, de 30 de julio de 2014, relativo a los requisitos para la transmisión de información a los consumidores sobre la ausencia o la presencia reducida de gluten en los alimentos.
3. Codex Stan 118-1979 (2008). Codex standard for foods for special dietary use for persons intolerant to gluten. Codex Alimentarius Commission.
4. Bustamante MA, Simón E, Churruca I, Fernández-Gil MP. Techniques for Analyzing Gluten. In: E. Simón, et al., Nutritional and Analytical Approaches of Gluten-Free Diet in Celiac Disease, Springer Briefs in Food, Health, and Nutrition. 2017. doi: 10.1007/978-3-319-53342-1_3.
5. Lexhaller B, Colgrave ML, Scherf KA. Characterization and Relative Quantitation of Wheat, Rye, and Barley Gluten Protein Types by Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry. Front Plant Sci. 2019;10:1530.
6. Alves TO, D’Almeida CTS, Scherf KA, Ferreira MSL. Modern Approaches in the Identification and Quantification of Immunogenic Peptides in Cereals by LC-MS/MS. Front Plant Sci. 2019;10:1470.
7. Lacorn M, Weiss T, Wehling P, Arlinghaus M, Scherf K. Quantification of Wheat, Rye, and Barley Gluten in Oat and Oat Products by ELISA RIDASCREEN® Total Gluten: Collaborative Study, First Action 2018.15. J AOAC Int. 2019;102:1535-43.
8. Lacorn M, Weiss T. Partially Hydrolyzed Gluten in Fermented Cereal-Based Products by R5 Competitive ELISA: Collaborative Study, First Action 2015.05. J AOAC Int. 2015;98(5):1346-54.
9. Kerpes R, Fischer S, Beckere T. The production of gluten-free beer: Degradation of hordeins during malting and brewing and the application of modern process technology focusing on endogenous malt peptidases. Trends Food Sci Technol. 2017;67:129-38.
10. Schall E, Scherf KA, Bugyi Z, Hajas L, Török K, Koehler P, et al. Characterisation and comparison of selected wheat (Triticum aestivum L.) cultivars and their blends to develop a gluten reference material. Food Chem. 2020;313:126049.
11. Tranquet O, Lupi R, Echasserieau-Laporte V, Pietri M, Larré C, Denery-Papini S. Characterization of Antibodies and Development of an Indirect Competitive Immunoassay for Detection of Deamidated Gluten. J Agric Food Chem. 2015;63:5403-9. doi: 10.1021/acs.jafc.5b00923.
12. Bustamante MA, Fernández-Gil MP, Churruca I, Miranda J, Lasa A, Navarro V, et al. Evolution of Gluten Content in Cereal-Based Gluten-Free Products: An Overview from 1998 to 2016. Nutrients. 2017;9(1).